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Document type: Tese
Access type: Acesso Embargado
Embargo Date: 2022-02-27
Title: Formulação de anfotericina B em lipossomas de circulação prolongada para o tratamento da leishmaniose visceral
Alternate title (s): Amphotericin B formulation in pegylated liposomes for the treatment of visceral leishmaniasis
Author: Faria, Karen Ferraz
First Advisor: Silva, Sydnei Magno da
First coorientator: Frézard, Fréderic Jean Georges
First member of the Committee: Ribeiro, Raul Rio
Second member of the Committee: Alves, Ceres Luciana
Third member of the Committee: Miranda, Juliana Silva
Fourth member of the Committee: Ribeiro, Vanessa da Silva
Summary: A leishmaniose visceral (LV) é uma doença parasitária grave, causada por Leishmania infantum e L. donovani. Estima-se que cerca de 300.000 novos casos resultem em ~30.000 mortes/ano em todo o mundo. O tratamento é a principal medida de controle, mas possui limitações, como toxicidade e linhas de alto custo. O objetivo desse estudo foi preparar, caracterizar e avaliar a eficácia terapêutica, in vitro e in vivo, de uma inovadora formulação lipossomal de circulação prolongada contendo AmB (LAmB-PEG), e de uma formulação lipossomal convencional (LAmB-Conv) para o tratamento da LV. Os lipossomas foram preparados pelo método de "Desidratação e reidratação das vesículas" e a média de diâmetro hidrodinâmico, potencial zeta (Z) e o índice de polidispersão (IP) das vesículas foram determinados por espectroscopia de correlação de fótons. O ensaio de citotoxicidade (CC50) foi realizado na linhagem celular RAW 264.7 pelo método colorimétrico MTT. Os valores da concentração inibitória (IC50) foram determinados pelo ensaio colorimétrico da resazurina nas cepas Leishmania (L.) infantum (MCAN/BR/2002/BH401). Em seguida, foi calculado o índice de seletividade (SI), estabelecido pela razão CC50/IC50. Camundongos BALB/c foram tratados de acordo com os seguintes protocolos (n=6): i- duas doses de LAmB-PEG (5mg/kg/96h/IP); ii- duas doses de LAmB-Conv (5mg/kg/96h/IP); iii- dez doses de AmB (5mg/kg/24h/IP); iv- 36 animais que não receberam nenhum tratamento. Após o tratamento, o sangue foi coletado e alíquotas de plasma foi utilizada para avaliar as funções renais (níveis séricos de uréia e creatinina) e hepáticas (níveis de transaminase pirúvica, transaminase oxaloacética, proteínas séricas totais e albumina). Camundongos BALB/c foram infectados com 107 promastigotas de L. infantum (MCAN/BR/2002/BH401) e vinte e cinco dias após a infecção, os animais foram tratados com dois protocolos terapêuticos (n=6): Protocolo 1: i- duas doses de LAmB-PEG (5mg/kg/96h/IP); ii- duas doses de LAmB-Conv (5mg/kg/96h/IP); iii- dez doses de AmB (5mg/kg/24h/IP); iv- dez doses de solução salina estéril (PBS) (24h). Protocolo 2: i- duas doses de LAmB-PEG (10mg/kg/96h/IP); ii- duas doses de LAmB-Conv (10mg/kg/96h/IP); iii- dez doses de AmB (5mg/kg/24h/IP); iv- dez doses de PBS (24h). Após o tratamento, os animais foram sacrificados e a carga parasitária no fígado e baço foi determinada pelo qPCR. As formulações preparadas nesse trabalho apresentaram características de nanosistemas estáveis, monodispersos com diâmetro hidrodinâmico médio inferior a 200nm. LAmB-PEG apresentou CC50, igual a 328,55μg/mL e LAmB-Conv igual a 316,1μg/mL, ambas taxas maiores que a AmB livre (265,61μg/mL), sugerindo menor toxicidade celular da droga em formulação lipossomal. Os valores de CI50, foram semelhantes para LAmB-PEG (20,365 ng/mL), LAmB-Conv (25,215ng/mL) e para AmB livre (38,305 ng/mL), sugerindo que não houve redução da atividade leishmanicida da AmB nas formulações. Contra amastigotas intracelulares, a LAmB-PEG reduziu significativamente as taxas de infecção dos macrófagos em relação ao controle (macrófagos sem tratamento), e macrófagos tratados com LAmB-Conv e AmB-D. Não houve alteração da função renal nos ensaios de toxicidade e eficácia terapêutica realizados em modelo murino. No entanto, as enzimas TGO e albumina, utilizadas para avaliar a função hepática, estavam aumentadas nos grupos tratados com LAmB-PEG, LAmB-Conv e AmB-D. Os demais parâmetros para avaliar a função hepática estavam dentro dos níveis de referência para as formulações. Os animais infectados com L. infantum e tratados com a formulação LAmB-PEG apresentaram redução significativa da carga parasitária no fígado e baço em relação ao grupo controle, nos protocolos terapêuticos avaliados (5mg/kg e 10mg/kg). Na dose de 10 mg/kg, no baço, a formulação LAmB-PEG apresentou diferença estatística com a AmB, indicando uma melhora na eficácia do fármaco ao ser encapsulado em vesícula lipossomal. Pela primeira vez a prova de conceito de que as formulações inovadoras de LAmB-PEG e LAmB-Conv induzem significativa redução das taxas de infecção de L. infantum, in vitro e in vivo, foi confirmada. Estes resultados reforçam o potencial terapêutico destas formulações e abrem novas perspectivas para o tratamento da LV.
Abstract: Visceral leishmaniasis (VL) is a serious parasitic disease, caused by Leishmania (L.) infantum and L. (L.) donovani. It is estimated that around 300,000 new cases result in ~30,000 deaths/year worldwide. Treatment is the main control measure, but it has limitations, such as toxicity and high cost lines. The objective of this study was to prepare, characterize and evaluate the therapeutic efficacy, in vitro and in vivo, of an innovative prolonged circulation liposomal formulation containing AmB (LAmB-PEG), and of a conventional liposomal formulation (LAmB-Conv) for the treatment of LV. The liposomes were prepared using the "Vesicle dehydration and rehydration" method and the average hydrodynamic diameter, zeta potential (Z) and the vesicles polydispersion index (IP) were determined by photon correlation spectroscopy. The cytotoxicity assay (CC50) was performed on the RAW 264.7 cell line by the MTT colorimetric method. The values of the inhibitory concentration (IC50) were determined by the colorimetric assay of resazurin in the Leishmania (L.) infantum strains (MCAN/BR/2002/BH401). Then, the selectivity index (SI) was calculated, established by the CC50/IC50 ratio. BALB/c mice were treated according to the following protocols (n = 6): i- two doses of LAmB-PEG (5mg/kg/96h/IP); ii- two doses of LAmB-Conv (5mg/kg/96h/IP); iii- ten doses of AmB (5mg/kg/24h/IP); iv- 36 animals that received no treatment. After treatment, blood was collected and plasma aliquots were used to assess renal (serum urea and creatinine levels) and liver functions (levels of pyruvic transaminase, oxaloacetic transaminase, total serum proteins and albumin). BALB/c mice were infected with 107 L. infantum promastigotes (MCAN/BR/2002/BH401) and twenty-five days after infection, the animals were treated with two therapeutic protocols (n = 6): Protocol 1: i- two doses of LAmB-PEG (5mg / kg / 96h / IP); ii- two doses of LAmB-Conv (5mg / kg / 96h / IP); iii- ten doses of AmB (5mg / kg / 24h / IP); iv- ten doses of sterile saline solution (PBS) (24h). Protocol 2: i- two doses of LAmB-PEG (10mg / kg / 96h / IP); ii- two doses of LAmB-Conv (10mg / kg / 96h / IP); iii- ten doses of AmB (5mg / kg / 24h / IP); iv- ten doses of sterile saline solution (PBS) (24h). After treatment, the animals were sacrificed and the parasitic load on the liver and spleen was determined by qPCR. The formulations prepared in this work showed characteristics of stable, monodispersed nanosystems with an average hydrodynamic diameter of less than 200nm. LAmB-PEG showed CC50, equal to 328.55μg/mL and LAmB-Conv equal to 316.1μg/mL, both rates higher than free AmB (265.61μg/mL), suggesting less cellular toxicity of the drug in liposomal formulation. IC50 values were similar for LAmB-PEG (20.365 ng/mL), LAmB-Conv (25.215ng/mL) and for free AmB (38.305 ng/mL), suggesting that there was no reduction in AmB leishmanicidal activity in the formulations. Against intracellular amastigotes, LAmB-PEG significantly reduced infection rates of macrophages compared to control (untreated macrophages), and macrophages treated with LAmB-Conv and AmB-D. There was no change in renal function in the toxicity and therapeutic efficacy tests performed in a murine model. However, the enzymes TGO and albumin, used to assess liver function, were increased in the groups treated with LAmB-PEG, LAmB-Conv and AmB-D. The other parameters to assess liver function were within the reference levels for the formulations. The animals infected with L. infantum and treated with the formulation LAmB-PEG showed a significant reduction in the parasitic load on the liver and spleen in relation to the control group, in the evaluated therapeutic protocols (5mg/kg and 10mg/kg). At a dose of 10 mg/kg, in the spleen, the formulation LAmB-PEG showed a statistical difference with AmB, indicating an improvement in the efficacy of the drug when it was encapsulated in a liposomal vesicle. For the first time, proof of concept that the innovative formulations of LAmB-PEG and LAmB-Conv induce a significant reduction in infection rates of L. infantum, in vitro and in vivo, has been confirmed. These results reinforce the therapeutic potential of these formulations and open new perspectives for the treatment of VL.
Keywords: Leishmaniose visceral
Tratamento
Anfotericina b
Lipossomas
Lipossomas de circulação prolongada
Visceral leishmaniasis
Treatment
Amphotericin B
Liposomes
Prolonged circulation liposomes
Area (s) of CNPq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS
Language: por
Country: Brasil
Publisher: Universidade Federal de Uberlândia
Program: Programa de Pós-graduação em Imunologia e Parasitologia Aplicadas
Quote: FARIA, Karen Ferraz. Formulação de anfotericina B em lipossomas de circulação prolongada para o tratamento da leishmaniose visceral. 2020. 82 f. Tese (Doutorado em Imunologia e Parasitologia Aplicadas) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2020. DOI http://doi.org/10.14393/ufu.te.2020.117.
Document identifier: http://doi.org/10.14393/ufu.te.2020.117
URI: https://repositorio.ufu.br/handle/123456789/29110
Date of defense: 27-Feb-2020
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