Please use this identifier to cite or link to this item: https://repositorio.ufu.br/handle/123456789/29509
ORCID:  http://orcid.org/0000-0002-0200-4836
Document type: Tese
Access type: Acesso Embargado
Embargo Date: 2022-07-29
Title: Papel das vias de reconhecimento de ácidos nucléicos TLR3-TRIF e cGAS-STING e de seu produto IFN-tipo I na infecção por Neospora caninum
Alternate title (s): Role of TLR3-TRIF and cGAS-STING nucleic acid recognition pathways and their product IFN-type I in Neospora caninum infection
Author: Miranda, Vanessa dos Santos
First Advisor: Mineo, Tiago Wilson Patriarca
First member of the Committee: Silva, Robinson Sabino da
Second member of the Committee: Lima Junior, Djalma de Souza
Third member of the Committee: Silva, Murilo Vieira da
Fourth member of the Committee: Bozza, Marcelo Torres
Summary: Neospora caninum é um protozoário intracelular obrigatório que pertence ao filo Apicomplexa e é o agente causador da neosporose, doença de grande importância médico- veterinária por causar abortos repetidos em bovinos ocasionados pela transmissão transplacentária do parasito, gerando grandes perdas econômicas em setores de corte e de leite. A importância econômica da neosporose tem levado a diversas pesquisas no desenvolvimento de estratégias para prevenção e tratamento desta infecção, incluindo pesquisas relacionadas a imunidade inata contra esse parasito. Nesse contexto, nosso trabalho teve como objetivo o estudo da participação das vias inatas de reconhecimento de ácidos nucléicos, TLR3-TRIF e cGAS-STING, bem como de seu produto comum IFN-tipo I na infecção por N. caninum. Nós observamos que camundongos TLR3-/- e TRIF-/- apresentam altas cargas parasitárias, aumento de inflamação tecidual e produção reduzida de IL-12p40, TNF, IFN-γ e óxido nítrico. Além disso, demonstramos que o RNA de N. caninum recruta TLR3 para o vacúolo parasitóforo e induz a translocação de IRF3 para o núcleo celular, induzindo a produção de IFN-tipo I. Vimos também que a expressão gênica de TRIF é aumentada durante a infecção pelo parasito em macrófagos, induzindo, por sua vez, aumento da expressão de IFN-α e IFN-β e em macrófagos TRIF-/- infectados houve redução de produção de IL-12p40, a qual foi completamente reestabelecida com a reposição de IFN-α recombinante. Nosso próximo objetivo foi verificar se, assim como o RNA, o DNA de N. caninum teria a mesma capacidade de ativação e indução de IFN- tipo I, sendo nesse caso, reconhecido pela via de cGAS-STING. Nossos resultados demonstraram que o DNA de N. caninum é capaz de induzir a produção de altas concentrações de IFN-α e IFN-β. Além disso, observamos que taquizoítos de N. caninum induzem o recrutamento citosólico de cGAS e STING após a invasão celular e esse recrutamento ocorre devido ao reconhecimento de seu DNA por esses sensores de ácidos nucléicos. Nós confirmamos no modelo de estudo de Neospora, que a via de cGAS-STING é essencial para a produção de IFN-α e IFN-β, visto que a infecção de células STING-/- com taquizoítos do parasito ou estímulo com seu DNA gera níveis drasticamente reduzidos dessas citocinas. Observamos ainda que STING modula positivamente a produção de IL-12 e IL-10, que são citocinas importantes na resposta imune contra N. caninum, e que o controle da replicação parasitária em macrófagos infectados é prejudicado na ausência dessa molécula. Por fim, nós avaliamos a importância de IFN-tipo I, produto comum das vias de TLR3 e cGAS, na resistência de camundongos infectados pelo protozoário N. caninum. Para isso, analisamos os índices de morbidade e mortalidade em animais WT e IFNAR-/- infectados com taquizoítos de N. caninum monitorados por 30 dias após a infecção e foi observado que na ausência de IFN-tipo I os camundongos são mais suscetíveis a infecção. Em seguida, realizamos infecções aguda e crônica para análises de parasitismo e inflamação tecidual, produção de citocinas, óxido nítrico e anticorpos específicos. Pudemos observar que os camundongos IFNAR-/- apresentaram maior carga parasitária nas células do lavado peritoneal, pulmões, fígado e cérebro quando comparados aos WT. Além disso, os animais knockout demonstraram grau moderado de inflamação tecidual hepática e cerebral, com múltiplos focos inflamatórios e, ocasionalmente, aparecimento de lesões necróticas, enquanto que os animais WT apresentaram leve grau de inflamação. Em relação a produção de citocinas, vimos que na ausência de IFN-tipo I a produção de IL-12 e IFN-γ é comprometida no soro, lavado peritoneal e fígado dos animais infectados, além de a produção de óxido nítrico também ser reduzida. Para confirmar esses resultados, realizamos dosagem de citocinas também in vitro, em sobrenadante de cultura de macrófagos derivados de medula óssea (BMDMs) de camundongos WT e IFNAR-/-, e observamos que durante a infecção por N. caninum há significativa redução da produção de IL-12 e IL-10 nos macrófagos knockout em comparação aos WT. Por fim, avaliamos a influência de IFN-tipo I na produção de anticorpos anti-N. caninum e observamos que essas citocinas não possuem influência direta no desenvolvimento da resposta imune humoral durante o curso da infecção. Em conjunto, nossos resultados mostram que o RNA de N. caninum é reconhecido pela via de TLR3-TRIF, a qual atua na resistência de camundongos infectados controlando o parasitismo e inflamação tecidual, marcadores importantes da doença. Além disso, o DNA de N. caninum é reconhecido pela via de cGAS-STING e induz a produção de IFN-tipo I, que age juntamente com a resposta imune do tipo Th1 para controle da replicação parasitária e aumento da resistência celular frente a infecção.
Abstract: Neospora caninum is an obligatory intracellular parasite that belongs to the phylum Apicomplexa and is the causative agent of neosporosis, a disease of great importance in veterinary medicine to cause repeated abortions in cattle by the transplacental transmission of the parasite, generating great economic losses in beef and dairy sectors. The economic importance of neosporosis has led to several studies in the development of strategies for the prevention and treatment of this infection, including researchs related to innate immunity against this parasite. In this context, our work aimed to study the participation of innate pathways of nucleic acid recognition, TLR3-TRIF and cGAS-STING, as well as their common product IFN-type I in N. caninum infection. We observed that TLR3-/- and TRIF-/- mice have high parasite loads, increased tissue inflammation and reduced production of IL-12p40, TNF, IFN-γ and nitric oxide. In addition, we demonstrated that N. caninum RNA recruits TLR3 for the parasitophore vacuole and induces translocation of IRF3 to the cell nucleus, activating the production of Type I IFN. We also saw that TRIF gene expression is increased during N. caninum infection in macrophages, inducing, in turn, increased expression of IFN-α and IFN-β and in infected TRIF-/- macrophages there was a reduction in IL-12p40 production, which was completely reestablished with the replacement of recombinant IFN-α. Our next objective was to verify whether, like RNA, the DNA of N. caninum would have the same ability to activate and induce Type I IFN, in which case it would be recognized by the cGAS-STING pathway. Our results demonstrated that N. caninum DNA is capable of inducing the production of high concentrations of IFN-α and IFN-β. In addition, we observed that N. caninum tachyzoites induce cytosolic recruitment of cGAS and STING after cell invasion and this recruitment occurs due to the recognition of its DNA by these nucleic acid sensors. We confirmed in the Neospora study model, that the cGAS-STING pathway is essential for the production of IFN-α and IFN-β, since infection of STING-/- cells with tachyzoites or stimulus with their DNA generates dramatically reduced levels of these cytokines. We also observed that STING positively modulates the production of IL-12 and IL-10, which are important cytokines in the immune response against N. caninum, and that the control of parasite replication in infected macrophages is impaired in the absence of this molecule. Finally, we evaluated the importance of Type I IFN, a common product of the TLR3 and cGAS pathways, in the resistance of mice infected with the protozoan N. caninum. For this, we analyzed the morbidity and mortality rates in WT and IFNAR-/- animals infected with N. caninum tachyzoites monitored for 30 days after infection and it was observed that in the absence of Type I IFN, mice are more susceptible to infection. Then, we performed acute and chronic infections for analysis of parasitism and tissue inflammation, production of cytokines, nitric oxide and specific antibodies. We observed that the IFNAR-/- mice had a higher parasite load on the cells of the peritoneal lavage, lungs, liver and brain when compared to WT. In addition, the knockout animals showed a moderate degree of hepatic and brain tissue inflammation, with multiple inflammatory foci and, occasionally, the appearance of necrotic lesions, while the WT animals showed a mild degree of inflammation. Regarding the production of cytokines, we saw that in the absence of Type I IFN, the production of IL-12 and IFN-γ is compromised in the serum, peritoneal lavage and liver of infected animals and the production of nitric oxide also being reduced. To confirm these results, we performed cytokine dosage also in vitro, in culture supernatant of bone marrow-derived macrophages (BMDMs) from WT and IFNAR-/- mice, and we observed that during the N. caninum infection there is a significant reduction in production of IL-12 and IL-10 in knockout macrophages compared to WT. Finally, we evaluated the influence of Type I IFN on the production of anti-N. caninum antibodies and we observed that these cytokines have no direct influence on the humoral immune response development during the course of the infection. Together, our results showed that N. caninum RNA is recognized by the TLR3-TRIF pathway, which acts on the resistance of infected mice by controlling parasitism and tissue inflammation, important markers of the disease. In addition, N. caninum DNA is recognized by the cGAS-STING pathway and induces the production of IFN-type I, which acts together with the Th1-type immune response to control parasite replication and increase cell resistance to infection.
Keywords: Imunologia
Neospora caninum
TLR3
TRIF
cGAS
STING
IFN-tipo I
Type I IFN
Area (s) of CNPq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS
Language: por
Country: Brasil
Publisher: Universidade Federal de Uberlândia
Program: Programa de Pós-graduação em Imunologia e Parasitologia Aplicadas
Quote: MIRANDA, Vanessa dos Santos. Papel das vias de reconhecimento de ácidos nucléicos TLR3-TRIF e cGAS-STING e de seu produto IFN-tipo I na infecção por Neospora caninum. 2020. 119f. Tese (Doutorado em Imunologia e Parasitologia Aplicadas) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2020. DOI http://doi.org/10.14393/ufu.te.2020.448.
Document identifier: http://doi.org/10.14393/ufu.te.2020.448
URI: https://repositorio.ufu.br/handle/123456789/29509
Date of defense: 29-Jun-2020
Appears in Collections:TESE - Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
PapelDasVias.pdf2.12 MBAdobe PDFThumbnail
View/Open


This item is licensed under a Creative Commons License Creative Commons